通常情況下，對于常用的反相色譜柱出現了嚴重的柱效降低、分離度差時，可以試試按照以下流程來對色譜柱進行沖洗、再生：
1、20倍柱體積水：乙腈= 95%：5% （用于移除系統中緩沖鹽，可根據常用緩沖鹽濃度調整比例）
2、20倍柱體積 乙腈
3、5倍柱體積 異丙醇
4、20倍柱體積 正己烷
5、20倍柱體積 乙腈
6、20倍柱體積 水：乙腈=95%：5% （可與步驟1保持相同的比例）
7、用所需的流動相比例重新平衡色譜柱
關于色譜柱的沖洗再生，基本上都是個性化的，也有很多相關文章，每支色譜柱的實際情況都會有所不同，適的再生條件需要經過實際摸索和調整。
在色譜柱沖洗時，很多實驗室習慣用沖洗時間來評價是不是達到我們想要的效果。例如某位師傅告訴你把這個柱子沖半個小時就可以了。嚴格來講色譜柱的沖洗應該使用沖洗的溶劑體積來評價沖洗效果，柱體積的計算公式如下：


例如一根4.6mm內徑，150mm柱長的色譜柱柱體積為：


如果要用20倍柱體積的乙腈沖洗色譜柱就需要約34mL的乙腈，假設柱流量是1mL/min，那就要用乙腈沖洗34分鐘，當柱流量是1.5 mL/min時就需要用乙腈沖洗約23分鐘。